ELISA檢測(cè)試劑盒的靈敏度(較低可檢測(cè)濃度)直接決定了其對(duì)微量目標(biāo)物的檢測(cè)能力，在疾病早期診斷(如病毒抗體篩查)、生物標(biāo)志物研究(如腫瘤標(biāo)志物)中尤為關(guān)鍵。提升靈敏度需從抗體性能與信號(hào)放大系統(tǒng)兩大核心環(huán)節(jié)優(yōu)化。
一、高親和力抗體：
抗體是ELISA中特異性結(jié)合目標(biāo)物的“核心鑰匙”，其親和力(抗體與抗原結(jié)合的強(qiáng)度)與特異性(僅識(shí)別目標(biāo)物)直接影響靈敏度。優(yōu)化策略包括：
•抗體篩選：優(yōu)先選擇單克隆抗體(特異性高)或高親和力多克隆抗體(結(jié)合能力強(qiáng))，通過(guò)ELISA預(yù)實(shí)驗(yàn)比較不同供應(yīng)商抗體的IC50值(半數(shù)抑制濃度，值越低親和力越高)；
•抗體配對(duì)優(yōu)化：夾心法ELISA中，捕獲抗體與檢測(cè)抗體需針對(duì)目標(biāo)物的不同表位(避免空間位阻)，且檢測(cè)抗體需偶聯(lián)酶(如HRP或AP)后保持高活性；
•抗體濃度調(diào)整：通過(guò)棋盤(pán)格滴定法確定較佳包被抗體濃度(通常0.1-1μg/mL)與檢測(cè)抗體濃度(0.5-2μg/mL)，過(guò)高濃度易導(dǎo)致非特異性結(jié)合，過(guò)低則降低捕獲效率。
二、信號(hào)放大系統(tǒng)：
傳統(tǒng)ELISA依賴HRP(辣根過(guò)氧化物酶)催化TMB(顯色底物)生成黃色產(chǎn)物，信號(hào)強(qiáng)度有限。通過(guò)引入信號(hào)放大技術(shù)，可顯著提升檢測(cè)靈敏度(降低至pg/mL級(jí)別)：
•納米材料增強(qiáng)：利用金納米顆粒(AuNPs)或量子點(diǎn)(QDs)標(biāo)記抗體，其表面等離子體共振效應(yīng)或熒光特性可增強(qiáng)顯色或熒光信號(hào)(如AuNPs-TMB體系顯色更深，檢測(cè)限降低10倍)。
•新型酶與底物：采用堿性磷酸酶(AP)替代HRP，搭配更靈敏的底物(如CSPD，化學(xué)發(fā)光底物)，通過(guò)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀讀取信號(hào)(靈敏度比TMB顯色高100-1000倍)。
三、其他輔助優(yōu)化：
•微孔板包被優(yōu)化：使用高結(jié)合力微孔板(如聚苯乙烯板經(jīng)特殊處理，蛋白結(jié)合量>300ng/cm²)，包被抗體時(shí)優(yōu)化緩沖液(如碳酸鹽緩沖液pH 9.6更利于抗體吸附)；
•反應(yīng)條件控制：延長(zhǎng)孵育時(shí)間(如檢測(cè)抗體孵育2小時(shí)代替1小時(shí))、提高酶活性(如HRP工作濃度優(yōu)化至0.1-0.5μg/mL)，均可提升信號(hào)強(qiáng)度。
通過(guò)高親和力抗體的精準(zhǔn)篩選與信號(hào)放大系統(tǒng)的創(chuàng)新設(shè)計(jì)，ELISA檢測(cè)試劑盒的靈敏度可實(shí)現(xiàn)數(shù)量級(jí)提升，為微量目標(biāo)物的檢測(cè)提供更強(qiáng)大的技術(shù)支撐，推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)與生物研究的發(fā)展。
